Установление категории выделительства при исследовании следов биологического происхождения

Генетическая экспертиза - Подать  заявку на проведение теста ДНКУзнать стоимость проведения теста ДНК
Установление категории выделительства при исследовании

Установление категории выделительства при исследовании

Предлагается устанавливать категорию выделительства человека с помощью выявления антигенов системы Lewis. С этой целью получены высокочувствительные и специфичные антитела и разработан простой и надежный метод ИФА, внедрение которого в практику позволяет повысить достоверность получаемых результатов.

Актуальной задачей при расследовании преступлений и осуществлении оперативно-розыскной деятельности является получение установочных данных на лиц, представляющих интерес для розыска. Одним из способов получения такой информации является криминалистическое исследование биологических следов: крови, слюны, волос, частиц кожи, ногтей, иных биологических объектов. Во всем мире такие исследования развиваются по двум направлениям, основанным на применении соответственно двух методов анализа — молекулярно-генетического (анализа ДНК) и иммунохимического.

Теоретически ДНК содержит полную информацию об организме-носителе, и со временем можно ожидать появления методик анализа биологических следов человека, позволяющих получать установочные данные на качественно новом уровне. Однако пока молекулярно-генетические исследования находятся на стадии интенсивного развития, ощущается нехватка квалифицированных кадров, а сами анализы и необходимое для их проведения оборудование являются весьма дорогостоящими. По этой причине на сегодняшний день иммунохимические методы остаются важнейшим инструментом криминалистики для исследования биологических следов (особенно при рутинном анализе).

Онлайн-заявка на проведение экспертизы

Так, общеизвестно, что важным дифференцирующим признаком человека является групповая принадлежность крови (например, по системе АВО, выделяющей четыре группы крови). Однако есть и ряд других характеристик такого рода, до настоящего времени не нашедших в криминалистике широкого применения ввиду относительной сложности определения или по иным объективным причинам. Их вовлечение в процесс исследования и формирования выводов может существенно повысить значимость получаемых результатов.

Одной из таких характеристик является категория выделительства человека. Это свойство может использоваться в качестве самостоятельного признака, позволяющего дифференцировать обнаруживаемые биологические следы человека и проводить сравнение образцов крови или слюны, полученных от конкретных лиц, со следами, обнаруженными на месте преступления [1] [2] [3].

Понятие выделительства было внедрено в практику в середине 20-х гг. XX в., когда в слюне были обнаружены групповые антигены системы АВО, а также отмечен тот факт, что феномен выделения групповых субстанций системы АВО со слюной не является каким-то постоянным (обязательным) признаком, а избирательно проявляется у различных людей, в связи с чем все они могут подразделяться на выделителей и невыделителей антигенов системы АВО. В дальнейшем была установлена генетическая обусловленность этих явлений, причем было показано, что способность к выделительству антигенов является доминантным наследуемым признаком [4]. Обнаружено, что в слюне антигены этой системы представлены в виде водорастворимых форм, а в других тканях — в виде спирторастворимых, причем наличие водорастворимых форм антигена в слюне связано с геном выделительства (Se), а наличие спирторастворимых форм в тканях и, в частности, на эритроцитах — не связано [5].

По данным разных авторов средняя частота встречаемости выделителей (Se) среди европейцев составляет приблизительно 80 %; остальные 20 % являются невыделителями своих групповых свойств [6].

В настоящее время в судебно-медицинской практике отнесение лиц к категории выделительства производится по таким косвенным признакам, как наличие или отсутствие групповых антигенов и в первую очередь антигена Н в выделениях, что нередко вызывает определенные трудности и может приводить к диагностическим ошибкам. Повысить достоверность анализа может выявление антигенов, наличие которых четко указывало бы на происхождение биологических следов от невыделителя или выделителя.

Такими антигенами являются антигены системы Lewis, которые, как установил R. Grubb [7], имеют генетическую корреляцию с системой выделительства. У невыделителей в большинстве случаев присутствует антиген Lea, а у выделителей — антиген Leb. Несмотря на то, что невыделители могут иметь генотип, при котором антиген Lea отсутствует, определение антигенов Lea и Leb делает отнесение к какой-либо из категорий более надежной.

Однако типирование образцов слюны или спермы по системе Lewis в настоящее время практически не проводится. Это связано в первую очередь с отсутствием антител, качество которых удовлетворяло бы повышенным требованиям, предъявляемым к реагентам, применяемым в судебно-медицинской экспертизе. Другим фактором является химическая схожесть Le- и Н-структур, присутствие минорных количеств антигенов Lec и Le3 у выделителей, затрудняющие дифференциацию биологических объектов по категории выделительства.

Нами была поставлена задача разработать простой и надежный метод отнесения следов выделений человека к той или иной категории выделительства посредством выявления в этих следах антигенов системы Lewis. Для ее решения на первом этапе были получены гибридомы-продуценты моноклональных анти-Lewis антител [8]. В качестве иммуногена была использована слюна выделителя ALeb и невыделителя ABLea. Антитела выбирались по их способности выявлять Lewis-антигены в образцах слюны. В результате проведенных исследований были отобраны три гибридомы, которым присвоили обозначения Е3С7 и 3D3-E7 (анти-Le3) и С5С10 (анти-Leb).

Данные антитела подвергли углубленному изучению. Было показано, что антитела клона 3D3-E7 (анти-Le3) и клона С5С10 (анти-Leb) позволяют надежно выявлять антигены Lewis в выделениях человека, причем моноклональные анти-Le3 антитела 3D3-E7 реагируют с образцами слюны более специфично, чем коммерческие анти-Le3 антитела. Кроме того, полученные антитела пригодны для использования в иммуноферментном анализе на нитроцеллюлозной мембране.

Получение высокоспецифичных моноклональных антител с анти-Le направленностью позволило дополнить применяемую в Институте криминалистики Центра специальной техники ФСБ России методику иммуноферментного анализа следов слюны [9] и при исследовании выделений одновременно с определением групповой принадлежности по системе АВО устанавливать категорию выделительства и определять фенотип по системе Lewis.

В ходе дальнейшей работы были получены конъюгаты соответствующих моноклональных антител с пероксидазой хрена, отработаны условия проведения анализа и пробоподготовки образцов. Это позволило создать одностадийную методику иммуноферментного анализа в дот-варианте для определения ABH-Lewis — антигенов в выделениях человека [10]. Общий принцип этого метода заключается в выявлении антигена в образце, нанесенном на нитроцеллюлозную, нейлоновую или другую мембрану, обладающую способностью связывать белки и некоторые другие высокомолекулярные соединения. Определение антигена проводится с помощью антител, меченных ферментом, например пероксидазой, и соответствующего субстрата — раствора 4-хлоро-1-нафтола в присутствии перекиси водорода [11]. При окислении субстрата в зонах локализации ферментативной активности развивается темно-синяя окраска за счет образования нерастворимого осадка.

Переход к одностадийному варианту выполнения анализа позволил сократить количество выполняемых операций и, как следствие, время проведения исследования, а также устранить трудности, связанные с подбором антител, меченных пероксидазой хрена, необходимых для двустадийного анализа (так, исследованные ранее антитела в ряде случаев неспецифически взаимодействовали со слюной или очень слабо реагировали с используемыми анти-ABH моноклональными антителами).

Для оценки возможности проведении экспертных исследований с помощью этой методики был проведен анализ образцов слюны от 117 человек, спермы от 23 мужчин и влагалищных выделений от 15 женщин.

Для исследования были взяты жидкие образцы слюны и образцы слюны, спермы и влагалищных выделений, высушенные на марле, с различным сроком хранения — от двух недель до 15 лет. B результате во всех образцах от лиц категории выделитель были выявлены соответствующие групповые антигены и антиген Leb. У лиц категории «невыделитель» ABH и Leb антигены в следах слюны не выявлялись, но выявлялся антиген Le3. Категория выделительства была правильно установлена во всех исследованных пробах.

B результате проведенной работы была создана реагентная база и отработана методика проведения одностадийного иммуноферментного дот-анализа, которая утверждена и внедрена в практику криминалистических исследований, проводимых Институтом криминалистики Центра специальной техники ФСБ России. Она зарекомендовала себя как простая в исполнении, чувствительная и надежная методика, значительно снижающая трудозатраты при определении групповой принадлежности следов выделений. Кроме того, ее несомненным преимуществом является возможность анализа той части объекта, которая непригодна для молекулярно-генетических исследований, что особенно важно при экспертизе микрообъектов.

Созданный на базе полученных для проведения таких исследований реагентов набор для определения групп крови и категории выделительства методом иммуноферментного анализа внедрен в практическую работу Института криминалистики Центра специальной техники ФСБ России, биологических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы Росздрава РФ и экспертно-криминалистических учреждений МВД России.

Авторы:

В.Ю. Александрова, Старший научный сотрудник Института криминалистики ЦСТ ФСБ России.

Е.А. Богатырева, Научный сотрудник Института криминалистики ЦСТ ФСБ России.

М.И. Лапенков, Зам. начальника отдела Института криминалистики ЦСТ ФСБ России, д-р мед. наук.

А.В. Фесенко, Советник группы консультантов ЦСТ ФСБ России, д-р техн. наук.

Е.Н. Храмов, Зам. директора по науке ФГУП «ГосНИИ БП» ФМБА России, д-р техн. наук.


  1. Томилин В.В., Барсегянц Л.О., Гладких А.С. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. М.: Медицина, 1989.
  2. Туманов А.К., Томилин В.В. Наследственный полиморфизм изоантигенов и ферментов крови в норме и патологии. М.: Медицина, 1969.
  3. Туманов А.К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств. М.: Медицина, 1975.
  4. Прокоп О., Геллер В. Группы крови человека. М.: Медицина, 1991.
  5. Race R., Sanger R. Blood groups in man. Oxford : Blackwell Scientific, 1975.
  6. Косяков П.Н. Изоантигены и изоантитела человека в норме и патологии. М.: Медицина, 1974.
  7. Grubb R. Correlation between Lewis group and secretor character in man Nature. 1948. Vol. 162.
  8. Лапенков М.И., Николаева Т. Л., Аборина Е.А. Получение, определение специфичности и применение моноклональных анти-Le антител // Судебно- медицинская экспертиза. 2000.№ 4.
  9. Дерюгина Е.И., Савельев Ю.И., Носырев А.Е., Лапенков М.И., Николаева Т.Л. Применение иммуноферментного анализа для определения АВН-антигенов в следах слюны и спермы // Судебно-медицинская экспертиза. 1992. № 2.
  10. Лапенков М.И., Богатырева Е.А., Александрова В.Ю., Смирнова В.К., Николаева Т.Л. Применение одностадийного иммуноферментного анализа для определения АВН-Lewis антигенов в следах выделений // Судебно-медицинская экспертиза. 2008. № 6.
  11. Jonstone A., Thorpe R. Immunochemistry in practice. Blackwell Scientific Publications, 1987.
Нашли в тексте ошибку? Выделите её, нажмите Ctrl + Enter, и мы всё исправим!